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石墨烯量子點制備及生物應用技術研究進展

發布日期:2020-5-26 16:31:49 訪問次數:41

石墨烯量子點制備及生物應用技術研究進展

  摘要:石墨烯量子點是一種重要的石墨烯衍生物,也是橫向尺寸最小的石墨烯衍生物。石墨烯量子點以其獨特的半導體性質、光學特性、生物安全性在生物醫藥、新能源、防偽涂層、光探測等領域得到了極大的關注。本文回顧了近年來石墨烯量子點制備技術及其在生物熒光成像、生物熒光檢測與診斷、可視化智能治療等生物應用技術方面的研究進展,同時對石墨烯量子點發展中存在的挑戰進行了簡要的總結。


1. 前言

作為一種新興的功能材料,石墨烯量子點以其優異的理化特性、低細胞毒性和出色的水分散性正逐漸取代已應用使用多年的半導體量子點(例如CdSe,CdTe和CdS等)并成為快速發展的熱點研究領域之一[1]。在過去的十余年中,石墨烯量子點的研究熱點不斷發生變化,主要的研究熱點包括合成方法創新、石墨烯量子點結構調制、石墨烯量子點發射波長的調制和量子產率提升。目前,石墨烯量子點制備技術方面已開發了主要涵蓋自下而上和自上而下方法的多種合成方法。石墨烯量子點結構調制方面,在過去的幾年已初步實現了邊緣結構調制、晶格摻雜和表面官能團的調節[1]。此外,當前石墨烯量子點的熒光發射波長已實現從深紫外到近紅外(250-800 nm)的可控調制。且石墨烯量子點的量子產率也得到了顯著的提升,可在一定程度上滿足各種應用的需求[2]。這一系列的研究進展使得石墨烯量子點在生物醫藥、光電催化,光電轉換,新能源等領域展現出重要的應用價值(圖1)。此篇研究進展回顧了近年來石墨烯量子點的制備技術及其在生物熒光成像、生物熒光檢測與診斷、可視化智能治療等生物應用技術方面的研究進展,同時對石墨烯量子點發展中存在的挑戰進行了簡要的總結。


圖1. 石墨烯量子點的制備及應用研究進展[1]

 

2.   石墨烯量子點的定義與相關性質

石墨烯量子點是一種極小尺寸的零維石墨烯碎片(圖2)。石墨烯量子點內核由蜂窩狀sp2碳結構所構成,其邊緣通常由含氧官能團(如羥基、羧基、羰基、環氧基等)所飽和[2]。石墨烯量子點所具有的典型sp2晶格結構是其與碳點區分的重要指標之一(碳點通常由sp2/sp3雜化的較高碳化程度內核與較低碳化程度的外殼所構成,圖2)。在量子尺寸效應的作用下,石墨烯量子點的基本物性(如帶隙,能帶位置和態密度)在很大程度上由量子力學效應所決定[3]。隨著尺寸的減小,石墨烯量子點的態密度由連續能級轉變為離散能級。進而當石墨烯量子點的尺寸減小到分子或原子尺寸,激子(電子-空穴對)被進一步限制,其能帶結構將進一步變得與分子電子結構相同。


圖2. 石墨烯量子點與碳點的結構對比[4]


上述過程的發生使得石墨烯量子點具有一系列獨特的性質,然而,對于石墨烯量子點出現量子尺寸效應的典型尺寸的定義目前仍存在很大分歧。表1列舉了不同文獻對石墨烯量子點典型尺寸的定義。由表可知,對石墨烯量子點典型厚度存在單層、1-2層、小于10層甚至1-10層以上等一系列大小不一的定義。另一方面,其典型橫向尺寸也存在從小于10 nm到小于100 nm不等的定義。目前,大多文獻報道中的石墨烯量子點典型的厚度小于10層,其典型的橫向尺寸小于10 nm。


表1.石墨烯量子點尺寸的不同定義(NA: 未提及)

 

3.   石墨烯量子點的制備

石墨烯量子點的制備是其基本物性研究及應用研究的基石。目前,石墨烯量子點的制備技術主要可歸類為以大尺寸碳材料前驅體的剪切為主要思路的自上而下法和以小分子、生物質材料碳化偶聯為主要思路的自下而上法兩類(圖3)[3]。這兩類制備技術在顯示各自優勢的同時也存在著或多或少的缺點。


圖3. 石墨烯量子點的不同制備思路[3]

 

3.1.自上而下法

作為獲得石墨烯量子點的最直接方法,自上而下法通過廉價易得的碳材料(石墨、碳納米管、石墨烯等[3])的剪切與氧化實現石墨烯量子點的制備。具體的實施方法包括物理剪切[4]、電化學剪切[3]和化學氧化剪切[2]等。Zhou等人以多壁碳納米管為工作電極,鉑絲為對電極,以0.1 mol/L四丁基高氯酸胺的乙腈溶液為電解液制備獲得了石墨烯量子點[14]。所獲得的石墨烯量子點發光波長位于藍光波段,量子產率為6.4%;Li等人以石墨為電極,氫氧化鈉/乙醇為電解質制備了不同尺寸的石墨烯量子點[15]。電化學法制備得到的石墨烯量子點通常具有良好的分散性、高結晶度,且易于純化。

相比電化學氧化剪切,化學氧化法在石墨烯量子點制備方面應用更為廣泛。目前主要的化學氧化反應體系借助混酸、自由基、溶劑熱環境等實現(圖4)[8]。其中混酸氧化法是最常用的化學氧化方案。雖然化學氧化法被廣泛應用于石墨烯量子點的制備,同時該方案制備獲得的石墨烯量子點往往具有較為完整的石墨烯sp2結構,然而該方案存在氧化反應安全性低(特別是混酸氧化方案)、酸性廢棄物處理困難、原材料利用率及量子點產率低下、純化困難等一系列問題,因此化學氧化剪切方案難以滿足日益增長的石墨烯量子點規模化制備的需求。

圖4.石墨烯量子點制備過程中常見的化學氧化體系[3]


3.2.自下而上法

隨著自上而下法的發展,研究人員發現,自上而下法存在所獲產物量子產率低、制備效率低且含有大量大尺寸副產物等一系列缺點。在石墨烯量子點sp2蜂窩狀結構的啟發下,研究者們開始利用小分子之間的碳化偶聯來制備石墨烯量子點,該類方法被稱為自下而上法。典型的自下而上法包括有機合成[4]、溶劑熱合成[8]、電化學合成等[4]。傳統的自下而上法通常利用有機小分子(如葡萄糖、蔗糖、乙二胺、尿素、檸檬酸等)實現石墨烯量子點的制備。此外,在綠色化學目標的指引下,大量生物質碳源(如榴蓮、雞蛋、稻草等)也被應用于石墨烯量子點的自下而上法制備中。水熱法和微波輔助法是生物質自下而上法制備方案中常用的技術。值得一提的是,Liangshi Li課題組通過精確的有機合成技術實現了一系列具有確定分子結構的石墨烯量子點的制備[16]。該課題組的系列研究工作提供了具有明確結構定義的石墨烯量子點材料,為石墨烯量子點基本物性研究奠定了重要基礎(圖5)。


圖5. 通過有機合成技術制備石墨烯量子點[16]


利用有機小分子進行石墨烯量子點自下而上法制備方面,熊煥明課題組以尿素和對苯二胺為原料通過水熱法制備了多種發光波長的石墨烯量子點[17]。其中紅光石墨烯量子點的量子產率為24%。該方法制備的石墨烯量子點具有穩定的熒光性能且展現出高量子產率,最高量子產率達94%。利用生物質碳源進行石墨烯量子點自下而上法制備方面,丁古巧課題組與寧波大學王剛課題組利用鉑催化劑對榴蓮進行水熱處理,實現了晶格S摻雜的石墨烯量子點的制備[18]。該量子點中S原子以噻吩結構存在于sp2晶格中(圖6),具有良好的光學和化學穩定性及超高的量子產率。該工作同時研究了水熱反應過程的詳細機理,明確了生物質碳源在復雜反應條件下量子點的合成機制。


圖6. 利用榴蓮實現的S摻雜石墨烯量子點自下而上制備[18]


雖然自下而上法解決了自上而下法存在的一些問題,但是其自身也面臨著石墨烯量子點碳化過程中的聚集、尺寸調制和產物均一性調制困難、副產物復雜等一系列問題。通常來說,自下而上法制備獲得的石墨烯量子點需要再進行如過濾、離心、透析、凝膠電泳和柱色譜的后處理。總之,石墨烯量子點的制備技術在近年來雖得到了長足的發展,但相較于已實現相對成熟規模化制備技術的其他石墨烯衍生物,石墨烯量子點的公斤級以上制備仍存在技術瓶頸,這一現狀嚴重阻礙了石墨烯量子點的應用技術發展。

 

4.   石墨烯量子點在生物醫藥領域的應用進展

傳統的半導體量子點(如CdSe、CdTe等)由于其可調節的熒光發射波長、高量子產率等一系列優勢,在需要穩定的強熒光應用領域使用了很長的時間。然而,傳統半導體量子點的高毒性限制了它們在臨床條件下的實際應用。相較而言,石墨烯量子點優異的化學惰性、生物相容性以及較低的制備成本使其在生物醫藥領域展現了顯著的優勢。目前,石墨烯量子點在生物醫藥領域的應用主要圍繞其典型的熒光性能展開,具體包括生物熒光成像、生物熒光檢測與診斷、可視化智能治療等。


4.1.生物熒光成像

借助石墨烯量子點的熒光特性,實現亞細胞、細胞、組織水平的熒光成像是石墨烯量子點最為重要和研究投入最多的應用領域之一。作為石墨烯量子點最早得到研究的應用場景之一,細胞水平的熒光成像是實現多樣化生物熒光成像的基礎,同時也為進一步的熒光診斷、可視化智能治療等技術的發展提供了重要的技術支持。孫靜等人通過在石墨烯量子點中引入晶格N原子,實現了石墨烯量子點量子產率的大幅提升,進一步的研究表明,該結構的石墨烯量子點在細胞質中穩定存在,可實現高效的細胞水平熒光成像[19]


圖7. (a–d)未經紅光發射石墨烯量子點處理的細胞僅顯示DAPI染色的細胞核,在近紅外波段無信號。(e-h)被DAPI和紅光發射石墨烯量子共標記的細胞其細胞質在近紅外波段顯示清晰的。(i-k)紅光發射石墨烯量子點標記后的細胞在流式細胞分析中的應用,準確率達到100%[20]


在進一步的研究中,研究者著眼于利用石墨烯量子點實現更大尺度下組織水平的活體熒光成像及更小尺度下亞細胞水平的生物熒光成像。這兩類成像技術對臨床診斷技術開發、疾病發生機理研究的發展具有重要意義。

組織水平熒光成像方面所面臨的主要困難在于實現紅光/近紅外發光波段石墨烯量子點的獲得。眾所周知,生物體自身熒光以藍綠光為主,因此多數藍綠光發光波段的石墨烯量子點在應用于組織水平的熒光成像時將面臨信號難以與生物體自身熒光相區分的問題。與此同時,短波長的藍綠色熒光低下的組織穿透深度也阻礙了目標組織在活體生物體外的有效熒光成像。為了解決該問題,研究者們針對紅光/近紅外發光石墨烯量子點的制備開展了大量的工作。Kumawat等人使用微波輔助方法處理芒果葉片的乙醇提取物獲得了紅色發光的石墨烯量子點[20]。所制備的石墨烯量子點在生物成像中被證明是有效的近紅外響應熒光探針,該量子點可選擇性地自定位在細胞質中(圖7);Jiechao Ge課題組制備了紅光/近紅外發射的石墨烯量子點,并證明了該量子點在體外熒光成像方面的重要意義[21]。同時,該研究工作為基于石墨烯量子點的高效腫瘤可視化光動力治療提供了重要的材料學基礎。


圖8. 石墨烯量子點在腫瘤細胞自噬泡中的富集[21]


亞細胞水平熒光成像方面,前期研究工作表明,石墨烯量子點主要通過濃度擴散及內吞過程自由分散于細胞的細胞質中,不具有顯著的亞細胞水平選擇性。這使得利用石墨烯量子點實現亞細胞水平的原位熒光監控存在困難。因此,實現基于石墨烯量子點的亞細胞水平熒光成像所面臨的主要問題在于通過合適的結構設計賦予石墨烯量子點特定的亞細胞水平選擇性。上海交大醫學院附屬第九人民醫院范先群課題組與微系統所丁古巧課題組發現晶格內N原子有序摻雜的石墨烯量子點可選擇性地富集于腫瘤細胞的自噬泡中(圖8),該研究工作不僅明確了腫瘤細胞在攝入石墨烯量子點之后的自我保護機制,同時也促進了腫瘤可視化智能治療技術的進一步開發[22];張忠平課題組制備了陽離子修飾的石墨烯量子點,該量子點具有追蹤細胞核中DNA和RNA的獨特能力(圖9),該量子點在分別與雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈RNA(ssRNA)結合后可發出光譜上可區分的熒光信號[23]


圖9.(a)修飾后的石墨烯量子點與細胞核內DNA和RNA相互作用的示意圖。dsDNA作用下石墨烯量子點發出綠色熒光,而ssRNA作用下石墨烯量子點發出紅色熒光。(b)石墨烯量子點處理的三種細胞系的熒光顯微照片。(c)石墨烯量子點處理的HeLa細胞同時被488和543 nm激發后的共聚焦顯微照片[23]


4.2.生物熒光檢測與診斷

在實現細胞、亞細胞、組織水平的熒光成像基礎上,研究者們借助對石墨烯量子點結構的修飾,逐步實現了大量重要疾病標志物的生物熒光檢測,進而開發了多樣化的疾病診斷技術。細胞內活性氧化物質(ROS)的評估可極大地加深人們對細胞代謝/增殖過程以及腫瘤發生機制的了解,同時有助于腫瘤診斷技術的開發。丁古巧課題組制備了Se摻雜的石墨烯量子點并成功實現了細胞內ROS代謝過程的原位熒光監控[24]。在此研究工作的基礎上,丁古巧課題組在石墨烯量子點中引入環三磷腈結構[25],該結構在細胞內ROS的氧化作用下可使石墨烯量子點的量子產率從12%大幅提升至63%。密度泛函理論計算和實驗結果證明環三磷腈環在被氧化后導致了石墨烯量子點電子云的強烈極化進而大幅提升了石墨烯量子點的量子產率。該量子點被進一步應用于細胞內ROS水平的長效評估,準確率為98.3%。進一步的研究表明,該結構的石墨烯量子點對多種腫瘤細胞具有優異的識別性能,腫瘤細胞、體細胞共培養體系下腫瘤細胞的識別率達到90%。血液內循環腫瘤細胞模型中該量子點對腫瘤細胞的識別率達到82.33%(圖10);Jingyu Shi等人報道了一種結合石墨烯量子點與金納米顆粒的新型熒光共振能量轉移生物傳感器[26]。該傳感器能夠對金黃色葡萄球菌的特異性基因序列進行定量檢測。通過對比加入目標物前后的整個體系的熒光變化,可對目標基因序列進行定量檢測,針對金黃色葡萄球菌的檢出限為1 nM。


圖10. 三聚磷腈環摻雜的石墨烯量子點的生物安全性及其在腫瘤檢測領域的應用演示[25]


IsraaAl-Ogaidi等人利用石墨烯量子點開發了一種化學發光免疫芯片,該芯片實現了卵巢癌標志物CA-125的定量檢測[27]。IsraaAl-Ogaidi等人首先將石墨烯量子點和CA-125捕獲抗體(cAB)依次連接于氨基改性的玻璃片表面,隨后利用牛血清白蛋白阻斷未反應的活性位點,在待檢測物與玻璃片結合后,加入辣根過氧化物酶(HPR)結合的捕獲抗體(Ab-HPR)。Ab-HPR能夠催化過氧化氫產生活性氧,并與魯米諾(Luminol)反應產生化學發光。該芯片對CA-125的檢出限為0.05 U mL-1(圖11)


圖11. 基于石墨烯量子點的化學發光免疫芯片工作原理示意圖[27]


4.3.可視化智能治療

在實現基于石墨烯量子點的生物成像技術的基礎上,研究者們進一步開展了石墨烯量子點在疾病可視化治療領域的相關探索。其中,針對腫瘤治療領域的應用探索是該研究領域的熱點。Jiechao Ge課題組證明了所制備的紅光/近紅外發射石墨烯量子點可作為一種新型光動力治療試劑用于腫瘤光動力治療中[21]。該石墨烯量子點可通過多態敏化過程產生單線態氧(1O2),1O2量子產率高達1.3,證明了該石墨烯量子點可用于腫瘤的可視化光動力治療(圖12)。


圖12.(a)在不同區域皮下注射石墨烯量子點后的明場圖像和(b)紅色熒光圖像。激發波長為502-540 nm,收集的熒光通道為695-775 nm。(c)在第1、9、17和25天進行各種處理后的小鼠照片。(PDT:石墨烯量子點注射并實施光照射;C1:僅注射石墨烯量子點;C2:僅光照射。)(d)不同治療后隨時間下的腫瘤生長曲線[21]

 

上海交大醫學院附屬第九人民醫院范先群課題組與微系統所丁古巧課題組在發現腫瘤細胞攝入石墨烯量子點后的自噬保護機制的基礎上,進一步提出了基于晶格內N原子有序摻雜石墨烯量子點和自噬抑制藥物連用的腫瘤可視化智能治療方案[28]。細胞、動物活體實驗評估結果表明,通過石墨烯量子點和自噬抑制藥物聯用,可實現腫瘤細胞的靶向高效殺滅。裸鼠皮下腫瘤模型實驗結果表明,上述治療方案在15天中使腫瘤體積顯著減小(腫瘤體積縮小75%),相比傳統化療藥物其效率提升3-4倍。與此同時,由于高效的靶向能力,治療過程中毒副作用顯著下降。在動物模型中未發現明顯全身毒性和器官損傷。該項研究為當前腫瘤治療技術中遇到的實時監控、高靶向率治療、抗耐藥性三大難點提供了新的思路和有效的解決方案。

在其他疾病的可視化治療領域,石墨烯量子點同樣也展現了超凡的應用前景。Jeremy J. Mao等人證明了石墨烯量子點在干細胞三系分化中的重要作用[29];Han Seok Ko等人證明了石墨烯量子點能夠穿透血腦屏障并有效抑制帕金森綜合征中的α-共核蛋白形成纖維化聚集體(圖13),從而實現神經細胞的保護,阻止了帕金森綜合征的發展[30]


圖13.石墨烯量子點與α-共核蛋白的相互作用[30]


5.   挑戰與展望

綜上所述,本文簡要回顧了近年來石墨烯量子點的制備技術及其在生物熒光成像、生物熒光檢測與診斷、可視化智能治療等生物醫藥領域的研究進展。十余年的發展使石墨烯量子點在諸多領域獲得了系列突破,然而該領域的研究仍面臨著諸多嚴峻的挑戰。首先,石墨烯量子點的規模化可控制備技術仍有待進一步開發,相較于已實現相對成熟規模化制備技術的其他石墨烯衍生物,石墨烯量子點的公斤級以上制備仍存在技術瓶頸,這一現狀嚴重阻礙了石墨烯量子點的應用技術發展;其次,石墨烯量子點發光機制模型仍存在諸多分歧,這使得石墨烯量子點光學性能的調制仍以“試錯法”為主要方法;再次,石墨烯量子點分子生物學層面的生物作用機制仍不明確,Han Seok Ko等人的相關研究工作證明了石墨烯量子點分子生物學層面的生物作用機制研究有助于相關應用技術的進一步開發;最后,具有實際應用市場價值的石墨烯量子點生物醫藥應用技術仍有待發展。這不僅是石墨烯量子點所面臨的重要現實問題,同樣也包括石墨烯在內的諸多新型功能材料所面臨的共性問題。

 

文章來源:上海烯望材料科技有限公司





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